怎么将流水线式的产出结果用于独特的生物学故事挖掘

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导读

通过测序分析拿到流水线式的结果，我们怎么去挖掘出属于自己的独特的生物学故事呢？下面小编就随便举一个例子，希望起到抛砖引玉的作用。

英文标题：Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma

发表期刊：Cell Research.

影响因子：20.507

研究背景

胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的一种胰腺癌，其特点是肿瘤内高度分化的异质性并且预后不良。

研究目的

为了全面描述肿瘤内PDAC的异质性及其形成的内在原因，为抗肿瘤免疫反应的预测提供新的方法。

由于文章篇幅很长，本文只详述肿瘤内PDAC的异质性及其形成的内在原因的挖掘部分。药物方面的研究不再描述。

研究方法

用24个PDAC病人样本和11个对照样本进行单细胞转录组测序分析（一般就是分亚群，差异表达，富集通路等）及围绕生物学故事需要补充的分析（一般就是免疫）。

我们通常会做处理组（本项目是PDAC胰腺导管腺癌细胞）和对照组细胞。我们通常得到的是流水线式的结果如下，需要好好的比对观察和思考。1.细胞亚群鉴定结果处理组： 对照组： 比对观察：

处理组和对照组之间到底有啥不同：看数目，一个10个亚群一个9个亚群，处理组比对照组多了个二型导管细胞（Ducta cell 2）；看比例，处理组的二型导管细胞比例是一型导管细胞比例的四倍，但是在对照组中接近一半比例的细胞都是一型导管细胞，并且没有二型导管细胞。

思考1：这是不是暗示了二型导管细胞和癌症之间是不是有某种关系，一型导管细胞和二型导管细胞又是什么关系？ 2.比较对照组和处理组的两种导管细胞

众所周知肿瘤存在多水平多层次的异质性，其中包括单核苷酸多态性、序列变异、微卫星改变及其不稳定、杂合子缺失、基因拷贝数改变以及染色体结构异常和非整倍体等核型变异。那么有必要看下在对照组和处理组两种导管细胞中CNV的情况。

比对观察：a：7个PDAC代表样本和一个对照组的CNVs得分小提琴图。b：7个代表样本和一个对照组的一型导管细胞和二型导管细胞的CNVs得分热图。c：对照组的CNVs得分，比较低。

看两种导管细胞热图颜色分布，基于CNV的分析显示一型导管细胞为相对正常，在非癌和肿瘤中均有出现，而PDAC中扩张的二型导管细胞则表现为恶性的。

思考2：那二型导管细胞十有八九跟癌症脱不了干系了，那一型导管细胞跟癌症有没有关系？一型导管细胞和二型导管细胞是什么关系呢？ 3. 研究一型导管细胞

比对观察：d：PDAC和对照组的一型导管细胞差异表达对比，上调1296个基因，下调 183个基因。e：在一型导管细胞中上调的基因中有1102个基因在二型导管细胞中同样高表达：说明这些基因在一型导管细胞中已经发生了表达失调。f：在一型导管细胞中表达上调的基因大多富集在与疾病相关的通路上：PDAC中一型导管细胞相对于对照组表现出异常状态。思考3：难道一型导管细胞是二型导管细胞的来源？那研究下PDAC 中的两种导管细胞是不是更能说明问题？ 4. 研究研究PDAC中两种导管细胞--差异基因富集分析 
比对观察：c ：PDAC中两种导管细胞的基因表达对比CPM (Counts per million) values were used to represent the normalized read count for each gene.差异表达基因3107个。d,g：功能富集分析， 二型导管细胞表达上调的基因主要富集于与癌症相关的功能，如细胞增殖、迁移和缺氧等进一步支持该类型的恶性状态；一型导管细胞表达上调的基因主要富集于正常的胰腺功能，包括消化、胰腺分泌物和碳酸氢盐转运。 5.研究PDAC中两种导管细胞--免疫组织化学分析
比对观察：e：在两种导管细胞差异表达基因中被发现的支持这种异常和恶化的细胞类型标记基因。f：对一型导管细胞的AMBP和二型导管细胞的MUC1和FXYD3进行免疫组织化学标记物染色，AMBP阳性细胞主要存在于导管细胞结构中，表现为正常的细胞特征，而另外两个阳性细胞表现为典型的肿瘤细胞特征。思考4：上面的分析再一次说明二型导管细胞是PDAC恶性细胞的主要来源，但是还不足以证明二型导管细胞是一型导管细胞转化过来的猜测。对了，单细胞转录组常规分析里面还有分化轨迹分析（细胞拟时序分析）结果，看看能不能从中找到答案。 6.研究PDAC两种导管细胞--试着找出分化轨迹（拟时序分析）一般拟时序分析需要找到一种中间细胞或者亚群。 对比观察:a-c：PDAC 一型导管细胞再分亚群，通过分亚群和做差异基因富集分析得出，亚群2中MUC1/AMBP的表达量升高。表明亚群2相对于亚群1细胞表现出二型导管细胞的某些恶性特征，并且亚群差异表达基因被富集到和肿瘤相关的信号通路中。d,a： 轨迹：腺泡细胞和MUC1-低导管细胞都可以转运到MUC1-高导管细胞，然后转化为恶性二型导管细胞。由于腺泡细胞数量的限制没有进一步研究腺泡向恶性导管细胞转变的进一步分析，主要研究了导管细胞转化的轨迹分析。 

沿着轨迹（纵坐标），确定了2299个具有动态表达变化的基因（横坐标），然后将其聚类，得到了4个异常基因表达模式（P1-P4）和4种恶性表达模式(P5-P8)。功能富集分析表明：导管细胞中功能正常的基因在恶性转变的过程中发生了异常的基因表达（在异常时期高表达，在恶化时期低表达）；相反一些经典的癌变途径，在PDAC进程中被激活特别是一大部分负责细胞增殖的基因在晚期被激活。

 思考5：这应该说明二型导管细胞是从一型导管细胞转化过来的。胰腺上皮内瘤样病变（PanIN）是公认的导管细胞形态学里肿瘤病变前的黏液性病变。是否能够找到这样的证据。 7.研究PDAC的二型导管细胞--panIN鉴定及轨迹分析 
h：用FXYD3标记为二型导管细胞和用阿利新蓝为PanIN免疫染色。发现PDAC肿瘤切片是FXYD3和Alcian blue均为阳性或仅为阳性，确认二型导管细胞中存在PanINs 。i：通过检测KPT19和MUC5AC来检测可能的PanIN亚群，发现1,2,3亚群表现明显的信号。表明这3个亚群应该表示PanIN状态的细胞。j：7个亚群轨迹分析：PanIN的人群（1,2,3）出现在早期阶段，其他人则出现在后期阶段。

结论

这已经足够证明了二型导管细胞是肿瘤细胞的主要来源，一型导管细胞是二型导管细胞的主要来源。即找到了肿瘤内PDAC的异质性及其形成的内在原因。

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文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31273297

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文：雨润草
排版：市场部

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